近年来诞生的CRISPR基因编辑技术，彻底改变了分子生物学，让我们拥有了前所未有的精确修改基因组的能力。但常规的CRISPR基因编辑技术会产生DNA双链断裂（DSB），这在临床治疗中，可能引发不良事件甚至带来严重的致命风险，包括不需要的插入或缺失突变、染色体规模突变、p53激活和细胞周期阻滞等等。此外，依赖于同源定向修复（HDR）的基因编辑技术依赖于细胞分裂周期，因此无法适用于所有细胞类型。下一代基因编辑技术尝试克服上述两个缺点，其中，碱基编辑和先导编辑被证明是成功的，但它们也存在着编辑范围有限、编辑效率低、易用性不足等缺点。2024年7月22日，哈佛医学院和麻省总医院的 Benjamin Kleinstiver 团队在 Nature Biotechnology 期刊发表题为：Click editing enables programmable genome writing using DNA polymerases and HUH endonucleases 的研究论文。该研究开发了一种名为点击编辑（Click editing，CE）的新型基因编辑技术，将HUH核酸内切酶（HUHe）、DNA依赖的DNA聚合酶（DDP）和RNA引导的Cas9切口酶（nCas9）结合，能够从简单的DNA模板进行可编程的精确基因组工程，包括对基因组的替换、插入和删除，这一研究成果为下一代基因编辑技术的开发指明了新方向。近期，已有研究开发出既能改变DNA序列，又不产生DNA双链断裂（DSB）的基因编辑技术，例如刘如谦团队开发的碱基编辑（Base editing，BE）和先导编辑（Prime editing，PE），但碱基编辑系统容易产生不必要的脱靶编辑，且只能编辑单个碱基，而先导编辑系统则存编辑效率偏低、pegRNA设计复杂等缺点。与其他类型的基因编辑器相比，该研究开发的基于DNA依赖的DNA聚合酶（DDP）的基因组编辑技术展现出无与伦比的潜力。DDP在细胞中普遍存在，可能在几乎任何类型的细胞中都具有酶活性，并且具有高亲和力、高保真聚合等优点。此外，DDP与广泛使用的、临床验证的和用户可指定的DNA寡核苷酸模板兼容，这可能在简单、可扩展性、可定制性、化学稳定性和编辑纯度方面具有优势。在这项最新研究中，研究团队设想将DDP融合或招募到DNA切口酶（nCas9）可能会创建一类与之前方法不同的基因编辑技术。研究团队推测，使用单链DNA（ssDNA）招募结构域可以实现修饰编码模板的定位，从而提高编辑效率。ssDNA模板应当由三个部分组成：1） 与核酸酶蛋白或多肽结合的识别序列；2）实现编辑替换的聚合模板（PT）；3）与靶位点的切割非靶链（NTS）具有同源性的引物结合位点（PBS）。理想的ssDNA招募结构域应该对ssDNA模板具有特异性，编码序列较小，催化融合蛋白-DNA复合物的动力学快速，并且不需要任何专门的修饰。HUH核酸内切酶（HUHe）是满足这些标准的蛋白质家族。HUHe是一类小蛋白，在绝大多数物种中均有分布，并且执行各种ssDNA特异性活动，包括ssDNA病毒复制、偶联和转座等。基于上述这些设想，研究团队开发了点击编辑器（Click editors），其中的nCas9能够在向导RNA（gRNA）的引导下靶向目标基因组位点并产生切口，HUH核酸内切酶（HUHe）将编码所需编辑的点击DNA（click DNA，clkDNA）模板共价连接到切口位点的基因组DNA上，然后，DNA依赖的DNA聚合酶（DPP）利用这些模板精确地引入基因编辑。不仅如此，使用未修饰的DNA分子作为点击DNA（clkDNA）模板的简单性，允许通过不同的参数快速优化编辑效率，包括编辑类型和额外的沉默突变。此外，clkDNA可以进行高通量筛选，而无需繁杂的分子克隆步骤。点击编辑系统在组成上是模块化的，可以使用各种DDP或HUHe结构域，具有进一步优化和工程化改造的潜力。通过对点击编辑及其clkDNA的模块化组件的迭代优化，研究团队证明了在多种永生化人类细胞类型和原代成纤维细胞中以最小插入或缺失突变的情况下进行精确基因组编辑的能力，且精确编辑效率高达30%。更重要的是，点击编辑系统可以实现多种类型的编辑，包括碱基替换、DNA短片段插入或删除，在可编程、通用性和精确度等方面表现优异，并且不产生DNA双链断裂（DSB），不依赖于同源定向修复（HDR），还能适用于各种生物应用。总的来说，这项研究开发了一种新型基因编辑技术——点击编辑，使用HUHe介导的共价clkDNA定位到DDP的目标位点，从而实现精确和通用的基因组写入。这一结果突出了DDP在基因编辑技术的应有优势，点击编辑系统的模块化和通用性使其可应用于广泛物种，并可作为各种应用的通用工具继续开发和优化，从而为基因编辑领域开辟了新的研究方向。https://www.nature.com/articles/s41587-024-02324-x
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